CPPC –DRPs的结构表征 

肽链中的两个 CPPC 基序在氧化后倾向于形成二聚体微型环（根据肽序列不同，可呈现平行或反平行取向）（图1a）。这一独特现象已被用于开发具有多样化二硫键框架的 CPPC –DRPs。针对重组E3泛素连接酶MDM2进行的文库筛选已获得具有独特共有序列F-X3-W-X2-L/I（X代表任意随机残基）的 CPPC –DRPs，该序列负责靶标结合。因此，研究人员利用二维1H-1H NOESY 实验获得的1H-1H距离约束条件，解析了所选 CPPC –DRPs之一（drp1）的三维结构（图1b；PDB 7W8K）。drp1由拉伸环、二硫键约束转角以及通过N/C端二聚体 CPPC 微型环锁定的α螺旋组成。该二聚体微型环具有刚性结构，与人免疫球蛋白G1重链铰链区的结构存在差异（图1c），这表明 CPPC 微型环在稳定肽链整体三维结构方面具有结构适应性。含共有序列的α螺旋区域与先前报道的p53肽α螺旋相似，叠加的主链原子间均方根偏差（RMSD）为0.733 A（图1d）。这与预期一致，因为MDM2表面存在一个深度α螺旋结合 ，该结构负责对α螺旋肽的特异性识别。这是此类肽的首个结构解析。这些发现表明 CPPC -DRPs能够维持稳定且独特的三维结构。

新型 CPPC -DRP的筛选与鉴定

通过 A仕er drp1的结构特征，我们意识到可以选择具有独特三维结构的 CPPC –DRPs，这些结构能够嵌入蛋白质的结合口袋中。因此，为了生成更多具有新三维结构的 CPPC –DRPs并探索 CPPC –DRPs可及的结构空间，研究人员通过改变半胱氨酸残基之间的间距构建了一个新的噬菌体展示 CPPC –DRPs文库，并针对MDM2及另一靶标（Keap1的Kelch结构域）36（具有不同类型的结合口袋）进行筛选（图2a）。  三轮筛选后，我们通过新一代测序（NGS）对富集的噬菌体库进行测序。在两个靶标筛选中，我们均获得了高度的序列富集（数据集S1和S2†）。对前50条序列的比对分析揭示了共有序列（图S1†）。MDM2结合肽的共有序列呈现F–X3–W–X2–L/I结构，该序列位于 CPPC – DRP 支架的不同区域（图2b；前10条序列），与drp1中的结构相似。Keap1结合肽的共有序列含有 ETGE 基序（图。2b和S2†），这是一种典型的肽基序，介导Nrf2与Keap1的相互作用。

随后对两种筛选中富集度最高的序列进行合成，并采用 HPLC 法检测其在氧化还原缓冲液中的氧化折叠过程。MDM2结合肽（drp2）的氧化反应生成两种产物（drp2-a和drp2-b），比例约为1:3（图2c）。通过先前描述的金光极化（FP）竞争实验测定，两种产物均能以亚纳摩尔级亲和力与MDM2结合（图S3†）。32随后通过核磁共振技术对两种产物结构进行表征（图2c；PDB 7W8O和7W8R）。两种产物均能保持稳定的三维结构，但具有不同的构象特征：其中保守的α螺旋结构负责靶标识别，这与肽链中两个 CPPC 基序（分别为drp2-a和drp2-b）的平行及反平行二聚体配对模式相对应。Keap1结合肽（drp3）的氧化反应在 HPLC 色谱图中呈现两个峰，比例约为3:1（图2d）。两种产物均能以亚微摩尔级亲和力与Keap1结合（通过表面等离子体共振法测定；图S4和S5†），但主要产物的结合亲和力显著高于次要产物。因此，研究人员随后利用核磁共振（NMR）技术确定了主要产物的三维结构，该结构呈现不规则的环状延伸构象，并通过平行 CPPC 微型环结构加以约束（图2d）。这些结果表明， CPPC -DRPs具有变色龙式支架特性，可实现三维结构的多样化构象变化，且通过针对具有不同类型结合口袋的蛋白质靶标进行肽库筛选，能够快速发现具有新结构和功能的 CPPC -DRPs。

基于结构的 CPPC -DRPs应用

结构表征研究极大地推动了天然DRPs在生物及生物医学应用中的工程化开发。17 CPPC –DRPs三维结构的可获得性将激发对 CPPC –DRPs设计与应用的新探索（图3a）。首先，这为利用 CPPC –DRPs作为模板，通过表位 gra仕ing 设计具有新结构和功能的 CPPC –DRPs提供了便利。例如，以drp1为模板，研究人员仅通过将drp1中受二硫键约束的转角替换为环状结构，便设计出新型肽段

在先前设计的微型蛋白质（PPa-Tyr）38中观察到螺旋折叠结构（图3a和b）。该肽段通过在N端融合小泛素相关修饰标签（SUMO）进行重组表达于大肠杆菌中。经SUMO标签 A仕er 切割后，氧化肽（drp4）采用 HPLC 法纯化（图S6t）。drp4的核磁共振结构显示：其含有新设计的延伸α螺旋结构，二聚体 CPPC 环的排列方式与drp1相比存在细微差异，而 环-α螺旋折叠的天然构象基本保持不变（图3b）。此外，drp4结构对热处理表现出极高稳定性——即使温度升至95℃，反映三维结构的圆二色性（CD）信号仅出现轻微下降（图S7t）。另一案例中，通过用可结合Keap1的表位（DEETGE）替换drp1中的二硫键约束转角，成功构建具有蛋白质结合能力的新型 CPPC -DRPs（图3a和c）。该 gra仕ed 肽（drp5；两种氧化产物；图S8t)能够以高纳摩尔级亲和力与Keap1结合（两种产物的KD值分别为153 nM和228 nM；图3d）。鉴于 CPPC – DRP 支架具有可修饰性，可通过设计和筛选二级结构库来探索序列进化，将表位锚定区域的多个甚至全部残基突变为其他氨基酸，从而提高靶标结合亲和力。通过这种方法筛选出新序列（数据集S3和图S9t），并对富集度最高的序列进行了验证。值得注意的是，如 HPLC 色谱图所示（图3e；经核磁共振表征证实），肽段drp6在氧化还原缓冲液中可折叠形成准单一氧化产物。该氧化肽段与Keap1的结合亲和力提升约3倍（KD：47 nM，图3e）。drp6的核磁共振结构显示其独特的 β 折叠构象，通过链间二硫键和反平行 CPPC 微型环结构得以稳定（图3e；PDB 7W96）。这些结果表明，结合表位 与文库筛选策略可用于发现新型 CPPC –DRPs。此外，发现由前体支架衍生的新结构既可能保持保守性，也可能呈现广泛变异。特别是二聚体 CPPC 配对方式（平行或反平行）的多样性可进一步扩大结构变异范围，从而能够探索天然DRPs和计算设计此前无法触及的肽结构空间广域区域。

1. 技术平台进展

· DDMP库的建立：厦门大学吴川六团队是核心开拓者。他们开发的定向二硫键多环肽（DDMP） 平台，解决了人工构建多环肽的难题。该方法像“分子乐高”一样，可以精准控制二硫键的配对，构建出自然界不存在的多环骨架，并能通过噬菌体展示等技术快速筛选出针对特定靶点（如HER2、FGFR1）的高亲和力配体。

· 结构与性能优化：在DDMP基础上，通过引入脯氨酸等氨基酸，能显著提升其氧化折叠效率（即更易合成）和进化潜力（利于药物筛选），同时保持对蛋白酶的抵抗力和结构稳定性。这为后续的工程化改造铺平了道路。

· 细胞穿透能力：这类结构赋予多肽“穿膜”的能力。受芋螺毒素等天然产物启发，通过模拟其构象或构建双环骨架，可使多肽穿透细胞膜，甚至实现肿瘤组织的深层渗透，这对于靶向胞内靶点（如蛋白-蛋白相互作用、胞内菌）至关重要。

 2. 应用转化进展

· 关键突破：CAR-T细胞疗法：这是目前最亮眼的成果。传统CAR-T疗法在实体瘤中易“误伤”正常组织（靶向/脱瘤毒性），且可能引发严重的细胞因子风暴。深圳湾实验室蔡羽轩团队将DDMP作为CAR-T的“眼睛”（识别结构域），实现了抗原密度门控效应。

  · 更高选择性：只对HER2或TROP2高表达的肿瘤细胞发动攻击，放过低表达的正常细胞，大大降低了脱靶风险。

  · 更安全：在有效杀伤肿瘤的同时，分泌的促炎细胞因子（如IFNγ、TNFα）显著减少，有望从源头降低细胞因子风暴的发生率。

· 其他拓展：除了肿瘤免疫，该技术还被用于开发抗菌肽、针对细胞内蛋白-蛋白相互作用的抑制剂等。天然的环胱氨酸结肽（如植物环肽）也常作为分子“脚手架”，通过嫁接活性序列来开发新药。

eg:Sarafotoxin S6a 是一种 Sarafotoxin 类似物，是一种内皮素受体 (endothelin receptor ) 激动剂，具有与 Endothelin-3 相似的 ETA/ETB 选择性。Sarafotoxin S6a 诱导猪冠状动脉的 EC50 值为 7.5 nM。