在 Fmoc 固相多肽合成（SPPS）中，根据巯基保护基的酸敏感性、脱保护条件、空间位阻、消旋化程度，主流使用的保护基可分为酸可裂解型（Trt、Thp、Dpm、Mmt）、特殊条件脱保护型（Acm、tBu）和固相选择性脱保护型（t-butylthio、STmp），其中Trt 是最常规的成本效益型保护基，Thp、Dpm 为近年优化升级款，Mmt 适合区域选择性二硫键构建，Acm/tBu 因使用有毒试剂已逐渐被淘汰。

在本文中土狗将围绕 Fmoc SPPS 体系，系统梳理不同 Cys 巯基保护基的结构特性、核心优势、适配场景、脱保护 / 裂解实操方法及副反应规避技巧，同时附标准化操作流程，覆盖从简单单 Cys 多肽到复杂多二硫键环肽的合成需求。 

酸可裂解型保护基：Fmoc SPPS 主流选择（Trt/Thp/Dpm/Mmt）

1. 三苯甲基（Trt）：最常规的成本效益型保护基

核心特性

• 酸敏感性：对浓 TFA 不稳定（常规裂解条件即可脱除），对稀 TFA（1% TFA/DCM）相对稳定；

• 脱保护原理：TFA 裂解下 Trt 基团脱落形成三苯甲基阳离子，该阳离子稳定性极高，导致脱保护反应可逆，易出现脱保护不完全；

• 偶联特性：偶联过程中存在一定消旋化（消旋率 3.3%），需选择温和的偶联试剂（如 DIPCDI/Oxyma Pure）。

适配场景

合成单 / 多个游离巯基的线性多肽，无复杂区域选择性二硫键构建需求；

常规实验室小试、中试，对成本控制要求较高的多肽合成。

关键实操：脱保护与裂解（副反应规避是核心）

• 淬灭三苯甲基阳离子：在裂解鸡尾酒中加入TIS（三异丙基硅烷）或TES（三乙基硅烷），不可逆地将阳离子转化为三苯甲烷，彻底完成脱保护；注意：含未保护色氨酸（Trp）的多肽禁用硅烷，硅烷会导致吲哚环还原，需更换其他淬灭剂；

• 防止巯基氧化 / 烷基化：添加2.5% 乙二硫醇（EDT），作为巯基保护剂维持多肽还原状态，最大程度减少巯基烷基化副产物；

• 裂解鸡尾酒用量：每 0.5 mmol 多肽使用 30 mL 裂解液（约 16 当量 EDT/Cys 残基）；若多肽含多个 Cys 残基 + 大量叔丁基（tBu）保护基，需增加 EDT 浓度或裂解液体积，保证淬灭和清除效果；

• 产物快速分离：含多个 Cys (Trt) 的多肽，裂解后直接将反应液沉淀至乙醚中，快速脱离裂解体系，避免巯基再次发生副反应；

• 常规裂解体系：TFA/TIS/EDT/H₂O（92.5:2.5:2.5:2.5），室温反应 2-3 小时，可实现完全脱保护与裂解。

2. 四氢吡喃基（Thp）：低消旋化的升级替代保护基

核心特性

• 酸敏感性：对浓 TFA 敏感（TFA / 水 / TIS=95:2.5:2.5 处理 2 小时可完全脱除），对稀 TFA（1% TFA/DCM）高度稳定，适配超酸不稳定树脂（Cltr、HMPB 树脂）上的受保护多肽片段合成；

• 偶联特性：消旋化程度极低，DIPCDI/Oxyma Pure 偶联时消旋率仅 0.74%（Trt 为 3.3%，Dpm 为 6.8%），大幅提升多肽手性纯度；

• 其他优势：C 端为 Cys (Thp) 时，Wang 树脂上长时间哌啶处理（Fmoc 脱保护）的消旋化、哌啶基丙氨酸形成显著降低；S-Thp 多肽比 S-Trt 多肽水溶性更强，减少裂解后多肽沉淀、损失。

适配场景

合成对消旋化要求高的半胱氨酸多肽（如 C 端为 Cys 的多肽、药用级高纯度多肽）；

在Cltr/HMPB 等超酸不稳定树脂上合成含 Cys 的受保护多肽片段（稀 TFA 下 Thp 稳定，可实现片段的选择性裂解与拼接）；

合成水溶性差的多肽，利用 S-Thp 的增溶特性提升产物收率。

标准脱保护 / 裂解方法

• 固相合成阶段：适配常规 Fmoc/tBu 策略，哌啶脱 Fmoc 无明显副反应，偶联优选 DIPCDI/Oxyma Pure，进一步降低消旋化；

• 裂解脱保护：采用TFA/H₂O/TIS=95:2.5:2.5裂解液，室温反应 2 小时，可实现 Thp 完全脱除，无需额外添加 EDT（巯基氧化风险低）；

• 片段合成：1% TFA/DCM 处理超酸不稳定树脂时，Thp 基团稳定，可选择性裂解得到受保护的 Cys (Thp) 多肽片段，用于汇聚合成。

3. 二苯甲基（Dpm）：区域选择性二硫键构建的专用保护基

核心特性

• 酸敏感性：对稀 TFA（1-3% TFA/DCM）高度稳定，仅能被浓 TFA（95%）脱除，与 Mmt（2% TFA 可脱除）形成完美的酸敏感梯度；

• 适配策略：与Cys(Mmt)组合使用，利用两者脱保护条件的差异，在固相上分步脱保护、分步氧化形成二硫键，实现区域选择性。

适配场景

• 含两个二硫键的环多肽的区域选择性合成（如药用环肽、生物活性环肽）；

• 需在固相上分步构建二硫键，对二硫键连接位点有精准要求的多肽合成。

核心应用：双二硫键环肽的区域选择性合成流程

固相合成：将含Cys(Mmt)和Cys(Dpm)的多肽序列组装在树脂上，Mmt 和 Dpm 分别保护不同位点的 Cys 巯基；

第一步脱保护与二硫键形成：用2% TFA/DCM处理树脂，选择性脱除 Mmt（Dpm 稳定），释放部分游离巯基，通过空气氧化或氧化剂处理形成第一个二硫键；

第二步裂解、脱保护与第二个二硫键形成：用TFA/DMSO/ 苯甲醚裂解鸡尾酒处理，一步完成：树脂裂解得到多肽、Dpm 基团脱除、剩余游离巯基被 DMSO 氧化形成第二个二硫键，最终得到区域选择性的双二硫键环肽。

4. 4 - 甲氧基三苯甲基（Mmt）：固相选择性脱保护的常用保护基

核心特性

酸敏感性：对稀 TFA（1-2% TFA/DCM）敏感，可快速脱除；对更稀的 TFA（<1%）或中性条件稳定，适配固相选择性操作；

可视化监测：脱保护时生成4 - 甲氧基三苯甲基阳离子，在 460 nm 处有特征吸光度，可通过分光光度法实时监测脱保护反应进程；

空间位阻：Mmt 基团空间位阻较大，可减少巯基在固相合成中的副反应。

适配场景

与 Dpm/Trt 联用，实现多二硫键环肽的区域选择性合成；

在固相载体上对巯基进行选择性修饰（如荧光标记、PEG 化）；

需分步释放巯基，进行固相上的多肽衍生化反应。

标准化脱保护方法（分批法 / 流动法，附实操细节）

方法 5-1：分批法（实验室常规小试）

预溶胀：在密封烧结玻璃漏斗中，用 DCM 预溶胀干燥树脂（1 g），去除多余 DCM；

脱保护：加入DCM/TFA/TIS=94:1:5裂解液（10 mL），密封漏斗（防止 DCM 挥发），摇动 2 分钟，通过N₂压力过滤（禁用真空，避免 DCM 快速蒸发）；

重复操作：步骤 2 重复 5 次，确保 Mmt 完全脱除；

后处理：用 DCM 洗涤树脂，真空干燥，树脂上得到含游离巯基的多肽。

方法 5-2：流动法（中试 / 规模化合成，可实时监测）

柱装填：用 DCM 预溶胀树脂（1 g），装入反应柱；

连续洗脱：以2 mL/min流速泵送1% TFA/DCM通过树脂柱；

实时监测：用 0.1 mm 流动池在460 nm处检测柱洗脱液的吸光度，吸光度回到基线表示反应完成；

后处理：反应完成后，用 DCM 冲洗柱子，得到固相上的游离巯基多肽。